Jack Bauer ist zurück, und erneut befindet sich die gesamte amerikanische Nation in Gefahr. Dieses mal wird das Land mit einem biologischen Kampfstoff bedroht, und nur einer kann die Terroristen aufhalten – Jack Bauer und sein Team von der CTU, der Antiterroreinheit.
Jack Bauer (Kiefer Sutherland) konnte nach sechs Monaten Undercover-Arbeit endlich den Drogenbaron Ramon Salazar (Joaquim de Almeida) dingfest machen.
Zurück in L.A. beginnt der Tag für Jack Bauer dieses mal um 13:00 Uhr. Vor dem Gebäude der Gesundheitsbehörde wird eine Leiche abgeladen, die mit einem tödlichen Virus infiziert ist. Die Ermittlungen der CTU führen zu dem Schluss, dass der Virus als getarnte Kokainlieferung über die mexikanische Grenze kam. Als Drahtzieher hinter diser Tat wird der Bruder von Ramon Salazar vermutet, der mit dieser Aktion seinen Bruder aus dem Gefängnis frei pressen will. Da der Präsident der Vereinigten Staaten, David Palmer (Dennis Haysbert) aber nicht mit Terroristen verhandelt, legt Jack ihm einen gefährlichen Plan vor, der den Präsidenten von jeglicher Verantwortung entbindet. Jack wird Ramon Salazar gewaltsam aus dem Gefängnis befreien, um ihn im Austausch gegen das Virus seinem Bruder zu übergeben…